La prueba diagnóstica de referencia para la HNP es la citometría de flujo. Esta prueba se realiza una vez que se han descartado otras posibles causas de anemia y tras obtener un resultado negativo en la prueba de Coombs directa (prueba de antiglobulina directa o DAT), que detecta la presencia de anticuerpos en la superficie de los glóbulos rojos en casos de hemólisis.

Los clones de HNP —es decir, las poblaciones que dan positivo en la prueba de la enfermedad— pueden clasificarse según sus síntomas:

• HPN clásica o hemolítica: hemólisis intravascular sin afectación de la médula ósea.
• HPN con afectación de la médula ósea: anemia aplásica o síndrome mielodisplásico (SMD).
• HPN asintomática: sin signos de hemólisis ni trombosis, a pesar de la identificación de clones de HPN.

En las células sanas, se expresan proteínas protectoras contra la vía alternativa del complemento (mediada por la proteína C3). La CD55 inhibe la actividad de las enzimas convertasas de C3 y C5; la CD59 impide la formación del MAC. Estas y otras proteínas se unen a la membrana celular a través de una molécula de anclaje denominada GPI (glicosilfosfatidilinositol). Las proteínas que dependen del GPI para su unión a la membrana se denominan GPI-AP (proteínas ancladas al GPI); las proteínas que no dependen de esta unión se denominan proteínas transmembranales, ya que contienen sus propios dominios que permiten el anclaje directo a la membrana.

La síntesis del GPI está regulada por varias proteínas codificadas por los genes PIG (fosfatidilinositol glicano). La PNH se asocia generalmente a una mutación en el gen PIG de clase A (PIGA), que impide la formación de la molécula y, por lo tanto, la unión de las GPI-AP a la célula. Sin las proteínas que protegen a la célula del complemento, esta se vuelve vulnerable a los ataques, lo que da lugar a la PNH. Durante la noche, la acidificación de la sangre potencia la vía alternativa del complemento, lo que aumenta la hemólisis (de ahí el carácter paroxístico nocturno de la enfermedad).

Existen otras mutaciones que también pueden provocar la PNH, como una mutación en el gen PIGT. En este caso, la deficiencia de GPI-AP no se debe a la ausencia de GPI (que sigue formándose), sino a que el gen PIGT media la unión entre el GPI y las GPI-AP. Aunque los efectos son similares, esta forma de PNH (PIGT-PNH) se manifiesta con síntomas autoinflamatorios.

La hemoglobinuria paroxística nocturna (HPN) es una enfermedad rara que provoca la destrucción de células sanguíneas: los glóbulos rojos (eritrocitos), responsables del transporte de oxígeno; los glóbulos blancos (leucocitos), células del sistema inmunitario; y las plaquetas (trombocitos), fragmentos celulares que intervienen en la coagulación de la sangre y la reparación de los tejidos.

La HPN se caracteriza, como su nombre indica, por la presencia de hemoglobina en la orina (hemoglobinuria) de forma intermitente (paroxística) y nocturna; esta hemoglobina procede de los glóbulos rojos destruidos (hemólisis).

Afecciones relacionadas: La destrucción precoz de células sanas puede dar lugar a varios trastornos:

• La hemólisis, cuando se produce de forma masiva, provoca anemia hemolítica debido a una reducción de los niveles de glóbulos rojos.
• Cuando la destrucción celular es generalizada y se produce muy temprano, impide la generación de nuevas células en la médula ósea, reduciendo excesivamente su número (pancitopenia); esto conduce a la aplasia de la médula ósea (anemia aplásica).
• La liberación de hemoglobina provoca una desregulación del óxido nítrico en la sangre, lo que reduce sus niveles. El óxido nítrico inhibe la agregación plaquetaria y la adhesión de las plaquetas entre sí y a los vasos sanguíneos; sin esta inhibición, existe riesgo de trombosis, es decir, la formación de coágulos que bloquean el flujo sanguíneo.

Causa y mecanismo de la enfermedad: La destrucción celular se produce mediante la activación del sistema del complemento, que forma parte del sistema inmunitario innato. Este sistema se basa en determinadas proteínas circulantes que se unen a un patógeno a través de diferentes vías de activación; esto desencadena una cascada de múltiples reacciones en las que intervienen proteínas, enzimas convertasas y fragmentos derivados de proteínas. La reacción en cadena culmina en la formación de un complejo de ataque a la membrana (MAC), compuesto por varios fragmentos enlazados que perforan y destruyen la célula diana.

Por último, pueden clasificarse según el tamaño del clon analizado dentro de una población objetivo:

El diagnóstico de la HPN puede basarse en una combinación de características de las células analizadas, concretamente en la presencia o ausencia de clones de HPN, el tamaño del clon detectado (la proporción entre células sanas y enfermas) y el nivel de expresión de GPI en dicho clon.

La gravedad de la enfermedad aumenta cuanto mayor es el tamaño del clon (HPN+ completa o HPN+ parcial alta) y cuanto mayor es la ausencia de GPI (tipo III).

En los eritrocitos, se utiliza un marcador independiente de GPI para la identificación exhaustiva; se trata del CD235a. A continuación, se utiliza el CD59 (y/o el CD55) para evaluar el nivel de expresión de GPI. La deficiencia de GPI puede ser completa o parcial; por lo tanto, los eritrocitos se clasifican según la expresión de GPI-AP: Tipo I, Tipo II y Tipo III. (Figura 1, A).

Posteriormente, se evalúa el tamaño de los clones PNH-positivos (Tipo II y Tipo III) para determinar la extensión de la enfermedad, es decir, si todas las células están afectadas (PNH+ completo) o si algunas están sanas (PNH+ parcial), y cuál es la proporción entre células afectadas y sanas. (Figura 1, B)

Figura 1. A) Identificación de los subtipos de eritrocitos CD235a+ según su nivel de expresión de CD59. B) Análisis del tamaño de cada tipo de célula.

Se utiliza un marcador panleucocitario, el CD45, para detectar leucocitos (Figura 2, A). A continuación, las poblaciones de interés se separan utilizando marcadores específicos: el CD15 para los neutrófilos (Figura 2, B) y el CD64 para los monocitos (Figura 2, C). Estos tres marcadores son independientes de la GPI. Los clones de la PNH se identifican mediante GPI-AP, CD157 (común a las células del linaje mieloide, como los neutrófilos y los monocitos) y FLAER, una molécula que se une específicamente a la GPI. Cuando se utilizan en combinación, se pueden evaluar el tamaño del clon y el nivel de expresión.

El análisis de FLAER/CD157 puede dar lugar a varias interpretaciones:

• Una célula sana debería expresar tanto GPI como CD157, por lo que se observará un resultado doblemente positivo (DP) en el análisis de FLAER/CD157.
• Un clon de PNH de tipo III no expresa GPI y, por lo tanto, tampoco expresará CD157. Esto da lugar a un resultado doblemente negativo (DN).
• Un clon de PNH de tipo II expresará GPI de forma parcial. Es habitual que estos clones sean solo débilmente positivos para FLAER y negativos para CD157. Esto se debe a que FLAER tiene una alta sensibilidad y detecta todas las moléculas de GPI. Como el CD157 está presente en proporciones menores y el anticuerpo utilizado no es tan sensible, la señal es indetectable. En este caso, nos encontramos ante un resultado de positividad única (SP).
• El tamaño del clon puede evaluarse en función de la presencia de una o más poblaciones. Una única población DP indica PNH-, una única población DN indica PNH+ completo, y dos poblaciones (DP y DN) indican PNH+ parcial.

En los leucocitos, el análisis del tamaño del clon es relevante; el nivel de expresión se analiza más fácilmente en los eritrocitos, aunque también puede realizarse en ellos.