Este ensayo multiantígeno por citometría de flujo mide la presencia o ausencia de tres inmunoglobulinas (IgG, IgA e IgM) contra cuatro antígenos diferentes del SARS-CoV-2 simultáneamente. Estos 4 antígenos son:

• Dominio de unión al receptor (RBD) de la glicoproteína S. Este dominio RBD es un trímero estabilizado permite la detección precisa de anticuerpos neutralizantes del subtipo IgG.
• Proteína SPIKE. Contamos con una glicoproteína trimérica Spike la cual es la forma nativa estabilizada de la proteína Spike del SARS-CoV-2.
• Desde el punto de vista del diagnóstico, el uso de estructuras triméricas para la SPIKE y el RBD detecta un repertorio más amplio de Anticuerpos Neutralizantes mejorando la sensibilidad y la precisión del monitoreo del estado inmune.
• Proteína de la nucleocápside (N). Esta proteína es muy inmunogénica y es la más abundante del virus. Presenta una gran afinidad por el RNA viral con el que interacciona.
• Principal proteasa del virus o la proteasa tipo 3C (3CLpro, Mpro) se caracteriza entre otras cosas porque sólo se expresa si el virus entra en nuestras células y por ser igual de inmunogénica que la Nucleocápsida. Investigadores del CSIC demostraron su utilidad para su uso en ensayos serológicos.

El motivo principal de analizar los 4 antígenos al mismo tiempo radica en la heterogeneidad de la respuesta inmune de cada paciente. Cuanta más información obtengamos en análisis de cada paciente, mejor diagnóstico podremos ofrecer. Al ir dirigido contra 4 antígenos es más difícil que se escape un falso negativo de un posible infectado o vacunado.

Efectivamente, la proteína S utilizada en este kit es una proteína recombinante y se puede comparar en su totalidad con la secuencia completa de la proteína S nativa. Además, conserva íntegra la estructura cuaternaria y glicosilaciones dado que se expresa en un sistema de expresión en mamíferos.

Si, la proteína Mpro ha demostrado ser más específica que la Nucleocápsida.

Como prueba de la especificidad llevada a cabo en la validación del kit, se analizó la posible reactividad cruzada de los anticuerpos contra otros microorganismos que producen síntomas similares a la infección por SARS-CoV-2. De esta manera se seleccionaron 15 muestras caracterizadas como positivas para IgG para los siguientes microorganismos: MERS-CoV, H. Influenzae, RSV, Influenza A, Influenza B , Parainfluenza, Adenovirus, Enterovirus M. pneumoniae, Legionella, C. pneumoniae.  Como control negativo se usaron muestras prepandémicas. 

Observamos en esta prueba cómo hay un patrón muy claro de que las muestras positivas analizadas no presentan reactividad cruzada con ninguno de estas enfermedades que producen síntomas similares al SARS-CoV-2. Los resultados obtenidos para la IgM fueron menos específicos que para la IgA y la IgG. Además, de los 4 antígenos analizados y que incluye el ensayo, se descubrió que la Mpro es más específica que la Nucleocápsida. Y esto es debido probablemente a la alta homología que la Nucleocápsida con otros coronavirus. La Mpro es la que presenta una menor homología entre otros coronavirus, por lo que la convierte en la proteína ideal para detectar el SARS-CoV-2.

Si, disponemos de un ensayo ELISA para la detección de anticuerpos IgG e IgA frente a la proteasa Mpro/3CLpro que ha demostrado ser altamente sensible y específico. Toda la información relativa al kit, datos de rendimiento y protocolo de ejecución lo pueden encontrar en la página de producto de este ensayo al que puede acceder a través del siguiente enlace a continuación.

La principal diferencia de información que aporta la RBD es que se ha demostrado que los anticuerpos que se generan frente a esta proteína son neutralizantes, sin embargo, si identificamos la proteína S en su totalidad, identificaremos también anticuerpos no neutralizantes, y de este modo se puede ver la diferencia en la titulación de los tipos de anticuerpos.

Si, en los estudios que hemos realizado hasta el momento hemos podido observar diferencias relacionadas con el tipo de vacunas, esperamos poder dar más datos sobre estas diferencias próximamente.

En apenas 8 pasos y en un tiempo aproximado de una hora y media, obtendremos las muestras listas para ser analizada en el citómetro. Este test es de tipo formato abierto, es decir, que se puede usar en cualquier citómetro de flujo, no tiene un equipo dedicado ni tiene que ser analizado con un software específico. Accede a este video para consultar el protocolo completo:

Si, el ensayo multiplex SARS-CoV-2 ha sido calibrado frente al Primer Estándar Internacional de la OMS para Inmunoglobulina anti-SARS-CoV-2 (humana)

En este sentido, es posible informar cuantitativamente de la concentración de inmunoglobulinas IgG en Unidades Internacionales (UI/ml) frente a RBD o en Unidades de Anticuerpos Unidos (BAU/ml) frente a S, N y Mpro. Para ello, el kit incluye un calibrador o estándar de concentración con el que poder hacer una recta de calibración mediante diluciones seriadas para cada uno de los antígenos víricos empleados en el test (RBD, S, N, Mpro) en la que interpolar los valores de fluorescencia resultantes del ensayo de las muestras, obteniendo de esta manera la concentración en UI/ml o BAU/ml correspondiente a cada muestra.

El kit cuenta con controles positivo y negativo para las 3 inmunoglobulinas, (IgA, IgG e IgM). Esos controles vienen en dos viales separados. La función de los controles positivo y negativo que incluye el kit es la de servir como control de calidad del ensayo, comparando los resultados en UA/ml con los datos que proporcionamos en el certificado de análisis. A continuación, mostramos un ejemplo de tabla del certificado de análisis de un lote aleatorio. Estos datos varían entre lotes, y se proporcionan tras la adquisición del kit.

También destacar que recomendamos utilizar un control positivo y negativo propio de cada laboratorio.

Según hemos establecido en la ficha técnica de producto para la interpretación de los resultados, el umbral o valor limítrofe es igual al valor medio a partir de los valores de intensidad mediana de fluorescencia de las réplicas correspondientes al control negativo por 3 veces la desviación estándar.

Umbral (valor limítrofe) = µ (mediana) ± 3σ (del control negativo).

Pueden encontrar toda la información sobre los componentes del kit, protocolo de ejecución e interpretación de los resultados en la página de producto de la web accediendo al siguiente enlace.

Disponemos de multitud de materiales de consulta sobre este ensayo accediendo a la página del producto, donde también está disponible la ficha técnica del ensayo con toda la información de los ensayos realizados para su validación. A continuación, dejamos un enlace a esta página donde poder descargarse dicha información.

Si, el ensayo ha sido validado para la mayoría de los citómetros de flujo de las marcas comerciales más conocidas como Becton Dickinson, Beckman Coulter y Cytek con resultados óptimos.

Para la correcta configuración de los citómetros puede descargar los datos de configuración para diferentes plataformas en nuestra página de producto, así mismo, en esta misma página dispone de un video tutorial de cómo ejecutar el protocolo del ensayo y cómo realizar la estrategia de gating en el citómetro. En especial, una recomendación que hacemos en este sentido es no adquirir las microesferas a velocidad máxima para evitar dobletes y debris.

Puede acceder al siguiente enlace para descargar estos materiales, o ponerse en contacto con nosotros para información adicional personalizada.

La realización de este ensayo es óptima en cualquier citómetro convencional, en la página de producto del kit proporcionamos los datos de los settings para la configuración del citómetro y en esa información viene incluido el treshold para poder realizar la adquisición correctamente.  A modo de ejemplo adjuntamos una imagen de cómo se separan las 4 poblaciones en un citómetro no expectral (BD Facs Calibur). Puede consultar los datos de configuración del citómetro en el siguiente enlace:

Si, realizamos un estudio entre individuos vacunados con vacunas de Pfizer, Moderna y AstraZeneca. Se realizó una comparación de las respuestas IgG e IgA contra los cuatro antígenos del SARS-CoV-2 de 65 individuos vacunados y se comparó con la de los individuos infectados naturalmente. Como se esperaba, los individuos vacunados sólo mostraron reacción a los antígenos S y RBD, y la IgG fue el isotipo predominante en los vacunados mientras que los sueros de los donantes infectados naturalmente presentaban anticuerpos contra los cuatro antígenos virales. 

Gracias a este ensayo podemos confirmar que sólo se producen anticuerpos frente a la proteína empleada en la vacuna, mientras que en una persona que ha sufrido la infección, también se generan anticuerpos frente al resto de antígenos incluidos en este test.

Pero como además el test es también cuantitativo, nos permitió saber la concentración y cantidad de las Ig generadas bien por efecto de las vacunas o por infección natural. De hecho, en análisis internos hemos confirmado que las vacunas, aunque son intramusculares, generan IgA (para SPIKE y para RBD) y no tanto IgM.

Curiosamente, sólo se observaron respuestas mínimas de IgA en los donantes vacunados, en contraste con los individuos infectados naturalmente que mostraron títulos elevados de IgA.

Las diferencias en las respuestas a diferentes isotipos Ig para las 4 proteínas nos permitió clasificar pacientes vacunados de pacientes que desarrollan anticuerpos como resultado de la vacunación. Pero, además, el test nos dió información sobre la población vacunada, como estaba respondiendo y si estaban generando anticuerpos o no frente a esas vacunas. 

Podemos afirmar que, gracias al análisis simultáneo de los 4 antígenos y de las 3 inmunoglobulinas de manera simultánea podemos clasificar a los pacientes según la severidad de la enfermedad.

En el proceso de validación del kit se realizó una prueba de sensibilidad donde se compararon 35 muestras que presentaban síntomas frente a muestras negativas y/o pre-pandémicas que no presentaban síntomas relacionados con el SARS-CoV-2. Pudimos observar que la expresión de los 4 antígenos analizados es bastante elevada en comparación con muestras que no presentaban síntomas.

Adicionalmente, también se evaluó la prueba en 44 muestras de plasma incluyendo 29 pacientes de COVID-19, 14 de ellos con enfermedad leve y 15 con enfermedad grave.

Cada muestra de plasma fue analizada en un rango de diluciones (1:100 a 1:5400) para tres isotipos (IgA, IgG, IgM). El análisis inicial mostró una clara diferencia entre la señal obtenida para los anticuerpos IgG contra los cuatro antígenos entre los controles sanos y los pacientes de COVID-19. Como era de esperar, aunque los anticuerpos IgA e IgM específicos del SARS-CoV-2 se detectaron en varios pacientes, no estaban presentes en todos los sueros analizados.

Si, en los estudios que hemos realizado hasta el momento hemos podido identificar algunas diferencias de respuesta según el tipo de vacuna, generando así diferentes tipos de perfiles de respuesta inmunológica a las vacunas. Esperamos poder continuar ampliando estos datos en el futuro en este sentido.

Efectivamente durante nuestras investigaciones hemos encontrado casos en algunas muestras pediátricas en las que no se encuentra la Nucleocápsida positiva, además esta proteína puede expresarse también como resultado de la vacunación en los casos de virus inactivados. Sin embargo, el ensayo también identifica anticuerpos frente a la proteasa principal del virus (Mpro) que en ningún caso se expresa por vacunación y es una enzima clave en el proceso de replicación viral del virus durante la infección natural, por lo que, en estos casos, se podría diferenciar con gran exactitud a través de los datos proporcionados con esta proteína.

Hemos podido observar una diferenciación de perfiles en este sentido cuando la expresión de la IgM está en su pico más alto, dado que no hemos encontrados casos de titulación alta de anticuerpos IgM en individuos vacunados, los anticuerpos generados como resultado de la vacunación son predominantemente IgG e IgA frente a las proteínas S y RBD.

Si, en nuestros estudios con este ensayo hemos observado diferencias significativas en las concentraciones de anticuerpos en el tiempo, y esperamos poder aportar más información sobre este asunto en el futuro.